2001年，参演个人首部电视剧《折扇探花》，正式进入演艺圈[1] 。2002年，参与拍摄唐季礼执导的足球题材青春励志剧《壮志雄心》[2] 。2006年，主演悬疑剧《谁懂我的心》，饰演罗一阳一角[3] 。2008年，主演青春励志题材剧《我是一棵小草》。2010年，主演的商战、爱情题材电视剧《金枝玉叶》在央视八套播出[4] 。2011年，参演医疗题材都市剧《心术》，在剧中饰演谷超华一角[5] 。2012年，主演励志轻喜剧《爱情面前谁怕谁》[6] 。
2013年，凭借电视剧《打狗棍》中二丫头一角，获得观众最喜爱的角色人物奖[7-8] 。2014年，主演的年代战争题材电视剧《勇敢的心》播出[9] ；同年，首次尝试网络剧的拍摄，主演悬疑灵异题材网络剧《灵魂摆渡》。2015年，继续主演《灵魂摆渡》系列网剧的第二部《灵魂摆渡2》[10] 。2016年11月，主演的《灵魂摆渡》系列最终季《灵魂摆渡3》在爱奇艺播出。
2011年，与吴秀波、张嘉译等人共同主演医疗行业剧《心术》，在剧中饰演因医闹被医院开出后转做处理医患关系的律师谷超华，并为该剧演唱主题曲《感动》[26-27] ；同年，参与拍摄胡静、陈楚河主演的民国宅斗戏《笑红颜》，饰演苏明利，并演唱了该剧的片尾曲《寻花》[28-29] ；后与黄海冰、张萌等人共同主演建党90周年献礼剧《开天辟地》，在剧中饰演反派汪精卫一角[30-31] ；同年主
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演由李惠民执导的谍战剧《生死钟声》，在剧中饰演风度翩翩、心机缜密、崇美思想严重的反面角色瞿言白[32] 。
2012年，出演个人首部电影作品《诡爱》，该剧根据于传松的同名恐怖小说《诡爱》改编而成，由梁婷执导，于2012年万圣节档期在中国上映；同年，参演由卢伦常和李文龙执导的都市情感励志轻喜剧《爱情面前谁怕谁》，饰演善良、正直的黎海波主管[33] 。
2013年，主演张多福执导的“幸福三部曲”系列电视剧中的第二部《幸福在哪里》，饰演腹黑反派韩江川[34] ；同年，在林添一执导，胡静、翁虹等主演的爱情题材年代剧《泪洒女人花》中饰演高立伯一角[35-36] ；同年，出演古装偶像剧《王的女人》，在剧中饰演陈国大王胡亥一角，该剧是于毅自出以来接拍的第二部古装剧；同年10月，凭借战争题材电视剧《打狗棍》中二丫头一角，获得了“2013年国剧盛典观众最喜爱角色”的荣誉奖项[37-38] 。
2014年，与杨志刚共同主演由郭靖宇、柏杉执导的年代传奇剧《勇敢的心》，饰演赵舒城，并演唱了该剧的主题曲和片尾曲两首曲目[39] ；同年，首次接触网络剧，主演中国悬疑灵异题材网络剧《灵魂摆渡》[40] ；随后，主演由张多福执导的抗战题材电视剧《绝地枪王》在四家卫视同步播出[41] 。
2015年，继续主演《灵魂摆渡》系列网剧的第二部《灵魂摆渡2》[10] ，并演唱同名主题曲《灵魂摆渡》[42] ，以及为该剧创作片尾曲《君生吾未生》[43] 。同年，主演由常晓阳执导的都市情感剧《转身遇到你》[44] 。
2016年，主演母爱主题剧《娘道》，于毅在剧中一人分饰两角，扮演一对出生大户人家，但性格命运迥异的孪生兄弟[45-46] ；同年11月，主演的《灵魂摆渡》系列季播剧的最终季《灵魂摆渡3》在爱奇艺播出。